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Since dimeric CQ derivatives have not been investigated for their effects on autophagy and as anticancer therapeutics, we designed Lys01, a dimeric form of CQ, with the spacer N, N-bis(2-aminoethyl)-methylamine as the connector between two CQ moieties. We then designed three derivatives of Lys01 that would serve as a preliminary test of the significance of dimerization, the C-7 chlorine, and the linker length for activity. Initial studies demonstrated that all three factors, dimerization, C-7 chlorine, and the linker length contribute to the enhanced activity in autophagy and cytotoxicity assays observed with Lys01. Lys01 treatment of LN229 and LN229 GFP-LC3 glioma cells produce a 10-fold more potent blockade of autophagy compared with CQ or HCQ as evidenced by LC3-II/LC3-I ratio on immunoblotting and the accumulation of large confluent GFP-LC3 puncta using fluorescence microscopy. Electron microscopy confirmed a massive difference in both size and number of autophagic vesicles that accumulate in cells treated with 10 µM Lys01 compared with 10 µM HCQ. A bafilomycin A 1 clamp experiment confirmed Lys01 is an autophagy inhibitor and not an autophagy inducer. The functional consequence of this more potent autophagy inhibition is that Lys01 treatment produces a 3- to 10-fold lower IC 50 in multiple human cancer cell lines using the 72 h MTT assay compared with CQ or other Lys01 derivatives tested, with more significant differences between Lys01- and HCQ-associated IC 50 s being observed in cell lines that are highly resistant to HCQ. To conduct in vivo studies we synthesized the water soluble salt of Lys01, Lys05.
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